Wenn in der giftigen RNA Impfung Graphenoxyd ist, wirkt es wie folgt

Erste umfassende Untersuchung von Graphenoxyd aus dem Jahre 2016 nach Entdeckung 2004

Erst-Veröffentlicht: 31. Oktober 2016       Luckenwalde den 06.12. 2021 

Toxizität von Nanopartikeln der Graphenfamilie: ein allgemeiner Überblick über die Ursprünge und Mechanismen   Forscher: Lingling Ou, Bin Song, Huimin Liang, Jia Liu, Xiaoli Feng, Bin Deng, Ting Sun & Longquan Shao

Abstrakt

Aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften werden Nanopartikelmaterialien der Graphen-Familie (GFNs) in vielen Bereichen, insbesondere in biomedizinischen Anwendungen, verwendet.

Derzeit haben viele Studien die Biokompatibilität und Toxizität von GFNs in vivo und intro untersucht.

Im Allgemeinen können GFNs in Tieren oder Zellmodellen unterschiedliche Toxizitätsgrade ausüben, indem sie verschiedenen Verabreichungswegen folgen und physiologische Barrieren durchdringen, anschließend in Geweben verteilt oder in Zellen lokalisiert werden und schließlich aus dem Körper ausgeschieden werden.

Dieser Review sammelt Studien zu den toxischen Wirkungen von GFNs in verschiedenen Organen und Zellmodellen.

Wir weisen auch darauf hin, dass verschiedene Faktoren die Toxizität von GFNs bestimmen, einschließlich der lateralen Größe, Oberflächenstruktur, Funktionalisierung, Ladung, Verunreinigungen, Aggregationen und Koronaeffekt ect.

Darüber hinaus wurden mehrere typische Mechanismen aufgedeckt, die der GFN-Toxizität zugrunde liegen, beispielsweise physische Zerstörung, oxidativer Stress, DNA-Schäden, Entzündungsreaktionen, Apoptose, Autophagie und Nekrose.

An diesen Mechanismen sind (toll-like Rezeptoren-) TLR-, Transforming Growth Factor β- (TGF-β-) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) abhängige Pfade im Signalweg-Netzwerk sowie oxidativer Stress beteiligt spielt auf diesen Wegen eine entscheidende Rolle. In diesem Review fassen wir die verfügbaren Informationen zu regulierenden Faktoren und den Mechanismen der GFN-Toxizität zusammen und schlagen einige Herausforderungen und Vorschläge für weitere Untersuchungen von GFNs vor, mit dem Ziel, die toxikologischen Mechanismen zu vervollständigen und Vorschläge zur Verbesserung der biologischen Sicherheit von GFNs zu machen und erleichtern deren breite Anwendung.

Hintergrund
Graphen, das aus kristallinem Graphit isoliert wird, ist eine flache Monoschicht, die aus einatomigen dicken, zweidimensionalen Blättern eines hexagonal angeordneten Wabengitters besteht [1].

Aufgrund seiner einzigartigen strukturellen, spezifischen Oberfläche und mechanischen Eigenschaften haben die Funktionen und Anwendungen von Graphen seit der Entdeckung des Materials im Jahr 2004 große Aufmerksamkeit erlangt [2, 3]. Graphen und seine Derivate umfassen Monolayer-Graphen, Wenigschicht-Graphen (FLG), Graphenoxid (GO), reduziertes Graphenoxid (rGO), Graphen-Nanoblätter (GNS) und Graphen-Nanobänder usw. [4–7].

GO ist eines der wichtigsten chemischen Graphen-Derivate der Graphen-Familie von Nanomaterialien (GFNs), das aufgrund seiner potenziellen biomedizinischen Anwendungen immer mehr Aufmerksamkeit auf sich zieht. Graphenbasierte Materialien haben normalerweise Größen von einigen bis zu Hunderten von Nanometern und sind 1-10 nm dick [8, 9], was auch die Definition von „Nanopartikeln“ oder „Nanomaterialien“ ist. Aufgrund ihrer außergewöhnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften werden Graphenmaterialien in verschiedenen Bereichen weit verbreitet verwendet, einschließlich der Energiespeicherung; nanoelektronische Geräte; Batterien [10-12]; und biomedizinische Anwendungen, wie antibakterielle Mittel [13, 14], Biosensoren [15–18], Zellbildgebung [19, 20], Wirkstoffabgabe [8, 21, 22] und Gewebezüchtung [23–25].

Mit zunehmender Anwendung und Produktion von GFNs steigt auch das Risiko einer unbeabsichtigten beruflichen oder umweltbedingten Exposition gegenüber GFNs [26]. Und vor kurzem gab es einige Untersuchungen zur GFN-Exposition in beruflichen Umgebungen, und veröffentlichte Daten zeigten, dass die berufliche Exposition von GFNs eine potenzielle Toxizität für Arbeiter und Forscher hatte [27–29]. GFNs können dem Körper durch intratracheale Instillation [30], orale Verabreichung [31], intravenöse Injektion [32], intraperitoneale Injektion [33] und subkutane Injektion [34] zugeführt werden.

GFNs können akute und chronische Gewebeverletzungen hervorrufen, indem sie die Blut-Luft-Schranke, die Blut-Hoden-Schranke, die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Plazenta-Schranke usw. durchdringen und sich in Lunge, Leber und Milz usw. anreichern.

Einige Graphen-Nanomaterialien-Aerosole können eingeatmet werden und eine erhebliche Ablagerung in den Atemwegen verursachen, und sie können leicht durch die tracheobronchialen Atemwege eindringen und dann in die unteren Atemwege der Lunge gelangen, was zur nachfolgenden Bildung von Granulomen, Lungenfibrose und nachteiligen gesundheitlichen Auswirkungen bei Exposition führt Personen [2, 29]. Mehrere Übersichten haben die einzigartigen Eigenschaften skizziert [35, 36] und die neuesten potentiellen biologischen Anwendungen von GFNs für die Wirkstoffabgabe, Genabgabe, Biosensoren, Gewebezüchtung und Neurochirurgie zusammengefasst [37–39]; bewertete die Biokompatibilität von GFNs in Zellen (Bakterien, Säugetiere und Pflanzen) [7, 40, 41] und Tieren (Mäuse und Zebrafische) [42]; sammelten Informationen über den Einfluss von GFNs in der Boden- und Wasserumgebung [43].

Obwohl in diesen Übersichten die entsprechenden Sicherheitsprofile und die Nanotoxikologie von GFNs erörtert wurden, waren die spezifischen Schlussfolgerungen und detaillierten Toxizitätsmechanismen unzureichend, und die Toxizitätsmechanismen wurden nicht vollständig zusammengefasst.

Die in neueren Studien nachgewiesenen toxikologischen Mechanismen von GFNs umfassen hauptsächlich Entzündungsreaktionen, DNA-Schäden, Apoptose, Autophagie und Nekrose usw., und diese Mechanismen können gesammelt werden, um das komplexe Netzwerk der Signalwege, das die Toxizität von GFNs reguliert, weiter zu erforschen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass es mehrere Faktoren gibt, die die Toxizität von GFNs stark beeinflussen, wie z der Toxizität von GFNs in vitro und in vivo durch verschiedene experimentelle Methoden, mit dem Ziel, Vorschläge für weitere Studien von GFNs zu geben und die toxikologischen Mechanismen zu vervollständigen, um die biologische Sicherheit von GFNs zu verbessern und ihre breite Anwendung zu erleichtern.

Toxizität von GFNs (in vivo und in vitro)
GFNs durchdringen die physiologischen Barrieren oder Zellstrukturen durch verschiedene Expositionswege oder Verabreichungswege und dringen in den Körper oder die Zellen ein, was schließlich zu einer Toxizität in vivo und in vitro führt. Die unterschiedlichen Verabreichungswege und Eintrittswege, die unterschiedliche Gewebeverteilung und Ausscheidung, sogar die unterschiedlichen Aufnahmemuster und -orte der Zellen können den Grad der Toxizität von GFNs bestimmen [44–46]. Sie zu verdeutlichen, kann daher hilfreich sein, um die Gesetze des Auftretens und der Entwicklung der GFN-Toxizität besser zu verstehen.

Verwaltungsweg
Die üblichen Verabreichungswege in Tiermodellen umfassen Atemwegsexposition (intranasale Insufflation, intratracheale Instillation und Inhalation), orale Verabreichung, intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und subkutane Injektion. Der Hauptexpositionsweg für GFNs in der Arbeitsumgebung ist die Atemwegsexposition, daher werden Inhalation und intratracheale Instillation hauptsächlich bei Mäusen verwendet, um die Exposition des Menschen gegenüber GFNs zu simulieren. Obwohl die Inhalationsmethode die realistischste Simulation der Exposition im wirklichen Leben bietet, ist die Instillation eine effektivere und zeitsparendere Methode, und es wurde festgestellt, dass GFNs eine längere Entzündungsperiode unter Instillation (intratracheale Instillation, intrapleurale Installation und pharyngeale Aspiration) als Inhalation verursachen [24, 30, 47, 48]. Es wurde untersucht, dass sich GFNs in der Lunge ablagern und zu einem hohen Niveau akkumulieren, das nach intratrachealer Instillation für mehr als 3 Monate in der Lunge mit langsamer Klärung verbleibt [49]. Die intravenöse Injektion wird auch häufig verwendet, um die Toxizität von Graphen-Nanomaterialien zu bewerten, und Graphen zirkuliert innerhalb von 30 Minuten durch den Körper von Mäusen und reichert sich in einer Arbeitskonzentration in Leber und Blase an [32, 50–52]. GO-Derivate hatten jedoch eine eher endliche intestinale Adsorption und wurden bei erwachsenen Mäusen durch orale Verabreichung schnell ausgeschieden [31, 53]. Nanogroßes GO (350 nm) führte dazu, dass nach subkutaner Injektion im Nackenbereich weniger mononukleäre Zellen in das subkutane Fettgewebe infiltrierten als mikrometergroßes GO (2 μm) [34]. GO agglomerierte nach intraperitonealer Injektion in der Nähe der Injektionsstelle, und zahlreiche kleinere Aggregate setzten sich in der Nähe der Leber- und Milzserosa ab [31, 33]. Experimente zu Hautkontakt mit oder Hautpermeation von GFNs wurden in den hier besprochenen Veröffentlichungen nicht gefunden, und es liegen keine ausreichenden Beweise vor, um den Schluss zu ziehen, dass Graphen intakte Haut oder Hautläsionen durchdringen kann. Der Weg der Nasentropfen, der häufig verwendet wurde, um die Neurotoxizität oder das Potenzial anderer Nanomaterialien für Hirnschädigungen zu testen, wurde in den hier besprochenen Artikeln nicht erwähnt.

Zugangspfade für GFNs
GFNs gelangen nach dem Eintritt in den Körper durch den Blutkreislauf oder durch biologische Barrieren an verschiedene Stellen, was zu einer unterschiedlichen Retention in verschiedenen Organen führt. Aufgrund ihrer Nanogröße können GFNs tiefere Organe erreichen, indem sie die normalen physiologischen Barrieren wie die Blut-Luft-Schranke, die Blut-Hoden-Schranke, die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Plazenta-Schranke passieren.

Blut-Luft-Schranke
Die Lunge ist ein potenzieller Eingang für Graphen-Nanopartikel in den menschlichen Körper durch die Atemwege. Die inhalierten GO-Nanoblätter können die Ultrastruktur und die biophysikalischen Eigenschaften des pulmonalen Tensidfilms (PS) zerstören, der die erste Verteidigungslinie des Wirts darstellt, und ihre potenzielle Toxizität hervorbringen [54]. Die agglomerierten oder dispergierten Partikel lagern sich auf der inneren Alveolaroberfläche innerhalb der Alveolen ab und werden dann von Alveolarmakrophagen (AMs) verschlungen [55]. Die Clearance in der Lunge wird durch die mukoziliäre Rolltreppe, AMs oder die Epithelschicht erleichtert [56–58]. Einige kleine, inhalierte Nanopartikel infiltrieren jedoch die intakte Lungenepithelbarriere und können dann vorübergehend in das Alveolarepithel oder das Interstitium gelangen [59, 60]. Intratracheal instilliertes Graphen kann sich durch Passieren der Luft-Blut-Schranke in Leber und Milz umverteilen [61]. Die Untersuchung der Blut-Luft-Schranke kann eine intensive Aufmerksamkeit auf sich ziehen, da Forscher und Arbeiter beruflich GFNs in der Regel durch Inhalation ausgesetzt sind. Die Rolle der Blut-Luft-Schranke bei der Toxizität von GFNs zu verdeutlichen, könnte ein heißes Forschungsthema werden.

Blut-Hirn-Schranke
Die komplizierte Anordnung der Blut-Hirn-Schranke, bestehend aus einer Vielzahl von Membranrezeptoren und hochselektiven Trägern, hat im Vergleich zum peripheren Gefäßendothel nur einen geringen Einfluss auf die Durchblutung und die Mikroumgebung des Gehirns [62]. Die Erforschung des Mechanismus der Blut-Hirn-Schranke hatte einige Fortschritte bei Krankheiten und Nanotoxizität gemacht. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)-Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) zeigte, dass rGO mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 342 ± 23,5 nm durch den parazellulären Weg in den interendothelialen Spalt zeitabhängig durchdringt, indem die parazelluläre Enge der Blut-Hirn-Schranke [63]. Darüber hinaus können Graphen-Quantenpunkte (GQDs) mit einer geringen Größe von weniger als 100 nm die Blut-Hirn-Schranke passieren [64]. Studien darüber, wie Graphenmaterialien die Blut-Hirn-Schranke passieren und Neurotoxizität verursachen, sind sehr selten, und es sind weitere Daten erforderlich, um eine Schlussfolgerung zu ziehen.

Blut-Hoden-Schranke
Die Blut-Hoden- und Blut-Nebenhoden-Schranken sind dafür bekannt, dass sie zu den engsten Blut-Gewebe-Schranken im Körper von Säugetieren gehören [65]. GO-Partikel mit Durchmessern von 54,9 ± 23,1 nm hatten nach intraabdominaler Injektion Schwierigkeiten, die Blut-Hoden- und Blut-Nebenhoden-Schranke zu durchdringen, und die Spermienqualität der Mäuse war selbst bei einer Dosierung von 300 mg/kg offensichtlich nicht beeinträchtigt [66].

Blut-Plazenta-Schranke
Die Plazentaschranke ist für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft unverzichtbar, da sie den Austausch von Nährstoffen und Stoffwechselschlacken vermittelt, lebenswichtige Stoffwechselfunktionen ausübt und Hormone ausschüttet [67]. Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung ergab, dass die Plazenta keine enge Barriere gegen die Übertragung von Nanopartikeln auf Föten darstellt, insbesondere gegen die Verteilung von kohlenstoffhaltigen Nanopartikeln auf und in den Föten [42]. Es wurde vermutet, dass rGO und Goldpartikel (Durchmesser 13 nm) in der späten Schwangerschaft nach intravenöser Injektion in der Plazenta und im Fetus kaum vorhanden sind oder fehlen [44, 68]. Andere Berichte zeigten jedoch, dass ein transplazentarer Transfer in späten Gestationsstadien stattfindet [69, 70]. Der Entwicklungstoxizität von Nanomaterialien wurde viel Aufmerksamkeit gewidmet, und Berichte zeigten, dass viele Nanopartikel die Plazentaschranke passieren und die Entwicklung von Embryonen stark beeinflussten [71–75]. Studien zur Exposition gegenüber Graphenmaterialien durch die Plazentaschranke sind jedoch mangelhaft, und wie diese Partikel auf Embryonen übertragen werden, sollte in Zukunft im Detail evaluiert werden.

Diese vier Barrieren waren die in der Literatur am häufigsten genannten Barrieren, und andere Barrieren wurden in neueren Studien nicht bewertet, wie beispielsweise Hautbarrieren, die in keiner der Hunderte von durchsuchten GFN-Toxizitätsstudien erwähnt wurden. Darüber hinaus ist der Mechanismus, mit dem GFNs diese Barrieren passieren, nicht gut verstanden, und es sind dringend systematischere Untersuchungen erforderlich.

Verteilung und Ausscheidung von GFNs im Gewebe
Die Absorption, Verteilung und Ausscheidung von Graphen-Nanopartikeln kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, einschließlich der Verabreichungswege, physikalisch-chemischen Eigenschaften, Partikelagglomeration und Oberflächenbeschichtung von GFNs.

Die unterschiedlichen Verabreichungswege beeinflussen die Verteilung von GFNs, beispielsweise intratracheal instilliertes FLG, das die Luft-Blut-Schranke passiert, hauptsächlich akkumuliert und in der Lunge zurückbleibt, wobei 47 % nach 4 Wochen verbleiben [61]. Intravenös verabreichtes GO gelangte über den Blutkreislauf in den Körper und wurde in Lunge, Leber, Milz und Knochenmark stark zurückgehalten, und in den Lungen von Mäusen wurden nach intravenöser Injektion von 10 mg kg/Körper entzündliche Zellinfiltration, Granulombildung und Lungenödem beobachtet Gewicht GO [49]. In ähnlicher Weise wurde eine hohe Akkumulation von PEGylierten GO-Derivaten im retikuloendothelialen (RES) System einschließlich Leber und Milz nach intraperitonealer Injektion beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten GO-PEG und FLG bei oraler Gabe keine nachweisbare Aufnahme in den Magen-Darm-Trakt oder Gewebeaufnahme [31].

Die unterschiedlichen Eigenschaften von GFNs, wie ihre Größe, Dosis und funktionelle Gruppen, führen immer zu inkonsistenten Ergebnissen in den Verteilungsprofilen von Graphen. Zhang et al. fanden heraus, dass GO hauptsächlich in der Mauslunge eingeschlossen war [49]; Li et al. beobachteten, dass GO in Mäuseleber akkumuliert [76]. Bemerkenswerterweise wurden kleine GO-Faltblätter mit Durchmessern von 10–30 nm hauptsächlich in Leber und Milz verteilt, während sich größere GO-Faltblätter (10–800 nm) hauptsächlich in der Lunge anreicherten [49, 52, 77]. Wenn die Größe von GO größer als die Größe der Gefäße ist, bleibt GO normalerweise in den Arterien und Kapillaren in der Nähe der Injektionsstelle stecken. Es wurde gezeigt, dass die Akkumulation von GO in der Lunge mit einer Erhöhung der injizierten Dosis und Größe zunimmt, die in der Leber jedoch signifikant abnimmt [78]. Die Beschichtung von biokompatiblen Polymeren auf GO beeinflusst auch die Bioverteilung, beispielsweise reichert sich die intravenöse Injektion von GO-PEG und GO-Dextran (GO-DEX) im retikuloendothelialen System (RES), einschließlich Leber und Milz, ohne kurzfristige Toxizität an [ 31, 79]. Darüber hinaus beeinflusst auch die Ladung von Plasmaproteinen und die Adsorption von GO durch Plasmaproteine ​​die Bioverteilung [34].

Die Ausscheidung und Clearance von GFNs variiert in verschiedenen Organen. In der Lunge deuteten Beobachtungen darauf hin, dass NGO von AMs angezogen und beseitigt werden, die durch mukoziliäre Clearance oder auf andere Weise aus dem Sputum eliminiert werden könnten [57] und 46,2 % des intratracheal instillierten FLG wurden 28 d nach der Exposition über den Stuhl ausgeschieden [61]. In der Leber können Nanopartikel über den hepatobiliären Weg nach dem Gallengang in den Zwölffingerdarm eliminiert werden [80]. Darüber hinaus kann PEGyliertes GNS, das sich hauptsächlich in Leber und Milz anreichert, allmählich eliminiert werden, wahrscheinlich sowohl durch die renale als auch durch die fäkale Ausscheidung. Wie kürzlich besprochen, werden GO-Folien größer als 200 nm durch physikalische Milzfiltration abgefangen, aber kleine Größen (ca. 8 nm) können die Nierentubuli in den Urin durchdringen und ohne offensichtliche Toxizität schnell entfernt werden [81]. Die Ausscheidungswege von GFNs sind noch nicht eindeutig geklärt, aber die renalen und fäkalen Wege scheinen die Haupteliminationswege für Graphen zu sein.

In letzter Zeit ist die Verteilungs- und Ausscheidungs-/Toxizitätsstrategie zu einem wichtigen Bestandteil nanotoxikologischer Studien geworden. Bis heute wurden in mehreren Veröffentlichungen mehrere umstrittene Ergebnisse zur Verteilung und Ausscheidung von Graphen in vivo berichtet, und eine systematische Bewertung der Toxikokinetik von GFNs ist noch erforderlich. Der Metabolismus und die Ausscheidung von Nanomaterialien sind lang anhaltende Prozesse, jedoch waren die jüngsten Studien zu GFNs auf kurzfristige toxikologische Bewertungen beschränkt, und die langfristige Akkumulation und Toxizität von GFNs auf verschiedenen Geweben bleibt unbekannt. Daher müssen Langzeitstudien zur Ablagerung und Ausscheidung von GFNs mit verschiedenen Zellen und Tieren durchgeführt werden, um die Biosicherheit der Materialien vor der Verwendung in humanbiomedizinischen Anwendungen zu gewährleisten.

Aufnahme und Lokalisierung von GFNs in Zellen
Es wurde auch beobachtet, dass die Aufnahme und Lokalisation von GFNs in verschiedenen Zelllinien unterschiedliche Wirkungen ausübt. Graphen wird über verschiedene Wege in Zellen aufgenommen [82, 83]. Grundsätzlich sind die physikalisch-chemischen Parameter wie Größe, Form, Beschichtung, Ladung, hydrodynamischer Durchmesser, isoelektrischer Punkt und pH-Gradient wichtig, damit GO die Zellmembran passieren kann [84]. Wie bereits erwähnt, können Nanopartikel mit Durchmessern <100 nm in Zellen eindringen und solche mit Durchmessern <40 nm in den Zellkern [85]. Beispielsweise durchdringen GQDs möglicherweise Zellmembranen direkt und nicht über energieabhängige Wege [86, 87]. Größere proteinbeschichtete Graphenoxid-Nanopartikel (PCGO) (~1 μm) dringen hauptsächlich durch Phagozytose in Zellen ein, und kleinere PCGO-Nanopartikel (~500 nm) gelangen hauptsächlich durch Clathrin-vermittelte Endozytose in Zellen [88]. GO-Faltblätter könnten an der Zellmembran anhaften und umhüllen, sich in die Lipiddoppelschicht einfügen oder als Folge von Interaktionen mit Zellen in die Zelle internalisiert werden [89]. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PEGyliertes reduziertes Graphenoxid (PrGO) und rGO aufgrund der Wechselwirkung von hydrophoben, unmodifizierten graphitischen Domänen mit der Zellmembran prominent an der Lipiddoppelschicht-Zellmembran haften [90, 91]. Folglich wurde vermutet, dass eine längere Exposition gegenüber Graphen oder eine hohe Konzentration von Graphen eine physikalische oder biologische Schädigung der Zellmembran sowie eine Destabilisierung der Aktinfilamente und des Zytoskeletts induziert [92].

Aktuelle Daten zeigen, dass GO-Faltblätter mit der Plasmamembran interagieren und von Makrophagen phagozytiert werden. An der Phagozytose des GNS sind drei Hauptrezeptoren auf Makrophagen beteiligt: ​​der Fcg-Rezeptor (FcgR), der Mannose-Rezeptor (MR) und der Komplement-Rezeptor (CR). Darüber hinaus ist FcgR ein Schlüsselrezeptor im vermittelten Phagozytoseweg [90, 93, 94]. Die Proteinkorona von GO fördert die Erkennung durch Makrophagenrezeptoren, insbesondere das in der Proteinkorona enthaltene IgG. Es wurde beobachtet, dass Makrophagen bei Kontakt mit GO erstaunliche morphologische Veränderungen durchmachen [34]. Nach der Internalisierung akkumulierte Graphen im Zellzytoplasma, im perinuklearen Raum und im Zellkern, was bei murinen Makrophagen durch Erhöhung des intrazellulären ROS durch Erschöpfung des mitochondrialen Membranpotentials und durch Auslösen der Apoptose durch Aktivierung des mitochondrialen Signalwegs eine Zytotoxizität induziert [83]. Die möglichen Wechselwirkungen und Akkumulationsstellen von GFNs sind in Abb. 1 zusammengefasst.

 

Abb. 1
Aus: Toxizität von Nanopartikeln der Graphenfamilie: ein allgemeiner Überblick über die Ursprünge und Mechanismen

Abb. 1
Graphenmaterialien und ihre biologischen Wechselwirkungen. (A) Ein Parameterraum für die am häufigsten verwendeten Graphenmaterialien kann durch die Abmessungen und die Oberflächenfunktionalisierung des Materials beschrieben werden, letztere definiert als der Prozentsatz der Kohlenstoffatome bei der sp3-Hybridisierung. Grüne Quadrate repräsentieren epitaktisch gewachsenes Graphen; gelbes, mechanisch abgeblättertes Graphen; rotes, chemisch abgeblättertes Graphen; blau, Graphenoxid. Beachten Sie, dass in Experimenten auch eine Reihe anderer mit Graphen verwandter Materialien (wie Graphen-Quantenpunkte und Graphen-Nanobänder) verwendet werden. (B) Mögliche Wechselwirkungen zwischen Graphen-verwandten Materialien mit Zellen (die Graphenflocken sind nicht maßstabsgetreu). (a) Adhäsion an der äußeren Oberfläche der Zellmembran. (b) Einbau zwischen die Monoschichten der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran. (c) Translokation der Membran. (d) Zytoplasmatische Internalisierung. (e) Clathrin-vermittelte Endozytose. (f) Endosomale oder phagosomale Internalisierung. (g) Lysosomale oder andere perinukleäre Kompartiment-Lokalisierung. (h) Exosomale Lokalisation. Die biologischen Folgen solcher Wechselwirkungen können je nach Kontext der jeweiligen biomedizinischen Anwendung als nachteilig oder vorteilhaft angesehen werden. Verschiedene mit Graphen verwandte Materialien werden unterschiedliche bevorzugte Mechanismen der Interaktion mit Zellen und Geweben aufweisen, die weitgehend auf ihre Entdeckung warten. [90] Copyright (2014), mit Genehmigung der American Association for Advancement of Science

Toxizität von GFNs in Organen
Die Toxizität und Biokompatibilität von GFNs wurde durch theoretische und Tiermodellstudien beobachtet und bewertet. Gegenwärtig gibt es eine Fülle von Daten, die die Toxizität von GFNs in verschiedenen Organen oder Systemen bei Tieren belegen, so dass es schwierig ist, alle Daten in dieser Übersicht aufzulisten. Daher haben wir eine Reihe von Literatur zusammengefasst und einige toxikologische In-vivo-Studien von GFNs ausgewählt, die in Tabelle 1 aufgeführt sind.

Tabelle 1 Toxizität von GFNs in Organen
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Toxizität in inneren Organen
GO kann durch Beeinträchtigung der normalen physiologischen Funktionen wichtiger Organe zu einer akuten Entzündungsreaktion und chronischen Verletzungen führen [32, 81]. Versuche mit oraler Sonde zeigten keine nachweisbare Aufnahme von GO durch den Magen-Darm-Trakt [95]. Interessanterweise verursachte eine niedrige GO-Dosis ernsthafte Schäden im Magen-Darm-Trakt, nachdem mütterliche Mäuse eine GO-Suspension anstelle einer hohen GO-Dosis getrunken hatten, da eine niedrige GO-Dosis ohne Agglomeration leicht an der Magen-Darm-Oberfläche haften und durch seine reichliche Menge Zerstörung verursachen kann scharfe Kanten [53]. GFNs verursachten eine Entzündung und verblieben am Tag 90 nach einer einmaligen intratrachealen Instillation in der Lunge und wurden sogar durch eine reine Naseninhalation in die Lungenlymphknoten transloziert [96, 97]. Eine hohe Dosis von Aggregaten bildendem GO kann pulmonale Blutgefäße blockieren und zu Atemnot führen [50, 98] und bei hohen Konzentrationen von 1 und 2 mg/kg KG wurden Thrombozytenthromben bei intravenöser Injektion beobachtet [89]. Berichten zufolge störte GO die Alveolar-Kapillar-Schranke, wodurch Entzündungszellen in die Lunge eindringen und die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine stimulieren konnten [99]. Fibrose und Entzündungen konnten durch die erhöhten Spiegel der Proteinmarker Kollagen1, Gr1, CD68 und CD11b in der Lunge nachgewiesen werden. Die Verwendung von Tween 80 zum Dispergieren von FLG oder einem Pluronic-Surfactant zum Dispergieren von Graphen wurde vorgeschlagen, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Lungenfibrose in Zellen oder Mäusen zu verringern, während Lungenfibrose beobachtet wurde, wenn Graphen mit Rinderserumalbumin (BSA) suspendiert wurde [100]. Darüber hinaus können radioaktive Isotope in die Lunge gelangen, begleitet von einer Tiefenverteilung von 125 I-NGO in der Lunge, die sich dort ablagern und zu Mutationen und Krebs führen können [30]. Neuere Veröffentlichungen behaupteten jedoch keine offensichtlichen pathologischen Veränderungen bei Mäusen, die niedrigen Dosen von GO und funktionalisiertem Graphen durch intravenöse Injektion ausgesetzt waren, einschließlich aminiertes GO (GO-NH2), Poly(acrylamid)-funktionalisiertes GO (GO-PAM), Poly(acrylsäure) )-funktionalisiertes GO (GO-PAA) und GO-PEG; nur GO-PEG und GO-PAA induzierten in vivo eine geringere Toxizität als reines GO [31, 79, 89]. Somit beeinflussen die funktionellen Gruppen von GFNs und die Arbeitskonzentration bzw. der Aggregatzustand maßgeblich die Toxizität von GFNs. In letzter Zeit werden die Möglichkeiten zur Modifizierung der funktionellen Gruppe von GFNs, zur Verringerung der Arbeitskonzentration oder zur Änderung des Aggregatzustands üblicherweise verwendet, um die Toxizität von GFNs zu verringern.

Toxizität im Zentralnervensystem
Graphen hat der Neurochirurgie durch die Anwendung der Wirkstoff-/Genabgabe zur Behandlung von Hirntumoren, intrakraniellen und spinalen biokompatiblen Geräten, Biosensorik und Bioimaging-Techniken großen Nutzen gebracht. Studien zu den Möglichkeiten oder Risiken von Graphen im Gehirn sind aufgetaucht. Im Hühnerembryomodell verringerten unberührte Graphenflocken den Ribonukleinsäurespiegel und die Geschwindigkeit der Desoxyribonukleinsäuresynthese, was zu schädlichen Auswirkungen auf die Entwicklung des Hirngewebes führte und die atypische Ultrastruktur im Gehirn beobachtet wurde [101]. Die neueren Forschungen zu GFNs im Zentralnervensystem befassen sich hauptsächlich mit der Anwendung und nicht mit der Toxizität. Die Daten der toxischen Studie zu GFNs sind im Gange.

Toxizität im Reproduktions- und Entwicklungssystem
Reines Graphen reduzierte die Vaskularisierung des Herzens und die Dichte verzweigter Gefäße nach Injektion in befruchtete Hühnereier und anschließender Inkubation für 19 d [101]. GO und rGO schädigen Zebrafischembryonen, indem sie die Embryoschlüpfrate und Körperlänge konzentrationsabhängig beeinflussen. Obwohl bei exponierten Zebrafischembryonen keine offensichtliche Missbildung oder Mortalität beobachtet wurde [102], haftete GO an und wurde in das Chorion der Zebrafischembryonen eingewickelt, was zu einer bemerkenswerten Hypoxie und Schlupfverzögerung führte. GO-Aggregate wurden in vielen Organellen wie Augen, Herz, Dottersack und Schwanz der Embryonen zurückgehalten, und in diesen Regionen wurden Apoptose und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beobachtet [103].

Die GFNs üben unterschiedliche toxikologische Wirkungen auf das männliche oder weibliche Fortpflanzungssystem aus. Die Daten zeigten, dass GO selbst bei hoher Dosis durch intraabdominale Injektion nur sehr geringe oder fast keine toxischen Wirkungen auf die männliche Reproduktion ausübte [66]. Darüber hinaus veränderte rGO die Serumöstrogenspiegel von nicht schwangeren weiblichen Mäusen nicht. Bei der weiblichen Maus ist der Zustand anders: Mäusemuttertiere könnten nach rGO-Injektion vor der Paarung oder während der frühen Trächtigkeit gesunde Nachkommen gebären, und nur wenige abnormale Föten

Einfluss der Hämokompatibilität
Die Freisetzung von GO ins Blut ist unvermeidlich. Es wurde festgestellt, dass die Hämokompatibilität von GO von der funktionellen Beschichtung und den Expositionsbedingungen abhängt. GO mit einer Größe im Submikronbereich führte zu der größten hämolytischen Aktivität, während aggregiertes Graphen die geringste hämolytische Reaktion induzierte. Reines Graphen und GO zeigten eine hämolytische Wirkung bis zu 75 µg/ml [104]. GO-Polyethylenimin (GO-PEI) zeigte eine bemerkenswerte Toxizität durch Bindung an HSA, selbst bei 1,6 µg/mL [105]. Carboxyliertes Graphenoxid (GO-COOH) zeigte eine signifikante Zytotoxizität gegenüber T-Lymphozyten bei Konzentrationen über 50 µg/ml und eine gute Biokompatibilität unter 25 µg/ml, während GO-Chitosan die hämolytische Aktivität nahezu hemmte [106]. Das entsprechende Risiko der Hämokompatibilität war bisher weitgehend unbekannt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die durch GFNs induzierte Lungenschädigung in mehreren Studien untersucht wurde, deren Ergebnisse eine entzündliche Zellinfiltration, Lungenödeme und Granulombildung in der Lunge gezeigt haben. Allerdings wurden nur wenige spezifische Studien an anderen Organen wie Leber, Milz und Niere ausgewertet, und die Verletzungssymptome, der Schadensindex und das Ausmaß der Schädigung dieser inneren Organe wurden nicht vollständig untersucht. Darüber hinaus sind Studien zur Neurotoxizität von GFNs recht selten; keine Daten haben ergeben, welche Nerven oder Hirnareale geschädigt sind, noch wurden die entsprechenden Verhaltensmanifestationen untersucht. Die Entwicklungstoxizität von GFNs kann zu strukturellen Anomalien, Wachstumsverzögerungen, Verhaltens- und Funktionsanomalien und sogar zum Tod führen. Eine Studie zur Reproduktions- und Entwicklungstoxizität von GFNs wird von großer Bedeutung sein und in Zukunft große Aufmerksamkeit erhalten. Fast alle Toxizitätsstudien von GFNs waren Kurzzeitexperimente, und keine Studien haben chronische toxische Langzeitschäden untersucht. Basierend auf Studien zur Toxizität anderer Nanomaterialien kann die langfristige Exposition mit GFNs jedoch ein wichtiger gesundheitsschädlicher Faktor sein [107–109]. Daher ist die Langzeitstudie von GFNs notwendig.

Toxizität von GFNs in Zellmodellen
Die Zytotoxizität von GFNs in vitro wurde in verschiedenen Zellen nachgewiesen, um die Lebensfähigkeit und Morphologie der Zellen zu verändern, die Membranintegrität zu zerstören und DNA-Schäden zu induzieren [110–112]. GO oder rGO verringern die Zelladhäsion; Zellapoptose induzieren; und dringen in Lysosomen, Mitochondrien, Zellkerne und Endoplasma ein [113]. GQDs traten in Zellen ein und induzierten DNA-Schäden durch die erhöhte Expression von p53-, Rad-51- und OGG1-Proteinen in NIH-3-T3-Zellen [87]. GQDs wiesen jedoch keine signifikante Toxizität gegenüber menschlichen Brustkrebszelllinien (bei einer Dosis von 50 µg/ml) oder menschlichen neuralen Stammzellen (bei einer Dosis von 250 µg/ml) auf [114, 115]. GO-Derivate verringerten die Expression differenzieller Gene, die für die Struktur und Funktion der Zellmembran verantwortlich sind, wie die Regulierung des Aktinzytoskeletts, die fokale Adhäsion und die Endozytose, dramatisch [89]. In Phäochromozytomzellen der Ratte (PC12-Zellen) verursachten Graphen und rGO zytotoxische Effekte und mitochondriale Schäden, wie die Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH), eine erhöhte Aktivierung von Caspase-3 und die Bildung von ROS [82, 116] .

Graphen kann die Lebensfähigkeit der Zellen erhöhen [117] oder den Zelltod verursachen [118], abhängig von der Zelllinie, der Art des Graphenmaterials und der Dosierung. GO-Zytotoxizität wurde in humanen Fibroblasten und Lungenepithelzellen bei Konzentrationen über 20 µg/ml nach 24 h beobachtet, jedoch wurde eine minimale Toxizität bei A549-Zellen bei Konzentrationen über 50 µg/ml gefunden [119]. Die durch GO induzierten biologischen Reaktionen wie ROS, Malondialdehyd (MDA) und LDH nahmen zu, während Superoxiddismutase (SOD) in HeLa-Zellen dosisabhängig abnahm [120]. GO-molecular beacon (GO-MB) zeigte jedoch selbst bei 20 µg/ml in HeLa-Zellen eine geringe Zytotoxizität [121]. GO verringerte die Lebensfähigkeit von A549-Zellen, während die gleiche Konzentration und Expositionszeit die Zelllebensfähigkeit von CaCo2-Kolorektalkarzinomzellen erhöhte [122]. Eine andere Studie berichtete, dass GO die Differenzierung von SH-SY5Y dramatisch verbesserte, begleitet von einer Erhöhung der Neuritenlänge und der Expression des neuronalen Markers MAP2 bei niedrigen Konzentrationen, dass GO jedoch die Lebensfähigkeit von SH-SY5Y-Zellen bei hohen Dosen (≥80 mg/ml) unterdrückte. [123]. Funktionalisierte Beschichtungen auf GO, wie GO-PEG [124] und GO-Chitosan [125], können die Zytotoxizität der Partikel durch Hemmung der Wechselwirkungen zwischen Zellen stark abschwächen.

Die Toxizität von GFNs in vitro ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Daten zur Zytotoxizität von Graphen-Nanomaterialien sind gegensätzlich und unterschiedliche Eigenschaften beeinflussen die Ergebnisse. Die Mechanismen und Einflussfaktoren der Toxizität müssen im Detail aufgeklärt werden.

Ursprünge der GFN-Toxizität
Berichten zufolge beeinflussen die Eigenschaften von Graphen, einschließlich seiner Konzentration, lateralen Dimension, Oberflächenstruktur, funktionellen Gruppen, Reinheit und Proteinkorona, stark seine Toxizität in biologischen Systemen [2, 7, 104, 126–129].

Konzentration
Zahlreiche Ergebnisse haben gezeigt, dass Graphenmaterialien bei Tieren und Zellen eine dosisabhängige Toxizität verursachen, wie Leber- und Nierenschäden, Lungengranulombildung, verminderte Zelllebensfähigkeit und Zellapoptose [130–134]. In-vivo-Studien zeigte GO keine offensichtliche Toxizität bei Mäusen, die einer niedrigen Dosis (0,1 mg) und einer mittleren Dosis (0,25 mg) ausgesetzt waren, induzierte jedoch bei einer hohen Dosis (0,4 mg) eine chronische Toxizität. Der hohe Gehalt an GO lagerte sich hauptsächlich in Lunge, Leber, Milz und Niere ab und war durch eine einzelne Schwanzveneninjektion von den Nieren nur schwer zu reinigen [135]. Interessanterweise führte eine Erhöhung der Dosis zu einer dramatischen Abnahme der hepatischen Aufnahme, jedoch zu einer Zunahme der pulmonalen Aufnahme von s-GO durch intravenöse Injektion [31], da die hohe Dosis von GO möglicherweise die Aufnahmesättigung übertraf oder die Masse an Plasma-Opsoninen verringerte , die folglich die hepatische Aufnahme unterdrückt. Darüber hinaus wurde in einer In-vitro-Studie berichtet, dass 20 µg/mL GO-Nanosheets innerhalb von 2 h nach Inkubation keine Zytotoxizität in A549 zeigten, eine höhere Konzentration (85 µg/mL) jedoch die Zellviabilität innerhalb von 24 h auf 50 % verringerte [136, 137] . Lüet al. zeigten auch, dass GO bei niedrigen Konzentrationen 96 h lang keine offensichtliche Zytotoxizität in einer humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zelllinie aufwies, jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung mit 100 mg/ml GO für 96 h Inkubation stark auf 20 % abnahm [123] . Die Ergebnisse in HeLa-Zellen, NIH-3 T3-Zellen und Brustkrebszellen (SKBR3, MCF7), die mit Graphen-Nanobändern behandelt wurden, zeigten ebenfalls eine dosis- (10–400 mg/ml) und zeitabhängige (12–48 h) Abnahme der Zelllebensfähigkeit [138]. Zunehmende Konzentrationen von GO gelangten in die Lysosomen, Mitochondrien, das Endoplasma und den Zellkern [119]. Mehrere Daten deuteten darauf hin, dass rGO bei einer niedrigeren Dosis und zu einem frühen Zeitpunkt den Apoptose-vermittelten Zelltod verursachte, dass jedoch mit zunehmender Zeit/Dosis Nekrose vorherrschte [110, 135].

Seitenmaß
Nanopartikel mit einer Größe < 100 nm können in die Zelle gelangen, < 40 nm in den Zellkern und kleiner als < 35 nm können die Blut-Hirn-Schranke passieren [85]. Eine Studie zeigte, dass GO (588, 556, 148 nm) nicht in A549-Zellen eindrang und keine offensichtliche Zytotoxizität aufwies [112]. Wenn der Durchmesser von Graphen zwischen 100 ~ 500 nm liegt, kann die kleinste Größe die stärkste Toxizität verursachen, und wenn der Durchmesser unter 40 nm liegt, können die kleinsten Größen die sichersten sein. Beispielsweise könnte rGO mit einem Durchmesser von 11 ± 4 nm in den Kern der hMSCs eindringen und bei sehr niedrigen Konzentrationen von 0,1 und 1,0 mg/mL in 1 h Chromosomenaberrationen und DNA-Fragmentierung verursachen. rGO-Faltblätter mit Durchmessern von 3,8 ± 0,4 nm zeigten jedoch selbst bei einer hohen Dosis von 100 mg/ml nach 24 h keine nennenswerte Genotoxizität in hMSCs [118].

In einer In-vivo-Studie akkumulierte s-GO (100–500 nm) bevorzugt in der Leber, wohingegen l-GO (1–5 µm) hauptsächlich in der Lunge lokalisiert war, da l-GO größere GO-Proteinkomplexe bildete, die gefiltert wurden durch die pulmonalen Kapillargefäße nach intravenöser Injektion [31]. Angesichts der relativen lateralen Größen (205,8 nm, 146,8 nm und 33,78 nm) der drei GO-Nanoblätter bei gleicher Konzentration erfährt kleineres GO in Hela-Zellen eine viel größere Aufnahme als größeres GO [139]. Die hohe Aufnahme von s-GO veränderte sich in der Mikroumgebung der Zellen und induzierte folglich den größten Verlust der Lebensfähigkeit und den schwerwiegendsten oxidativen Stress unter drei Größen von GO-Proben [119]. Als Ergebnis zeigte eine Studie, dass GO größenabhängig die M1-Polarisierung von Makrophagen und proinflammatorische Reaktionen in vitro und in vivo induzierte. Größeres GO zeigte eine stärkere Adsorption an die Plasmamembran mit weniger Phagozytose, löste robuste Interaktionen mit TLRs aus und aktivierte NF-κB-Wege im Vergleich zu kleineren GO-Faltblättern, die eher von Zellen aufgenommen wurden [94]. Um den detaillierten Mechanismus, der diesen Effekten zugrunde liegt, aufzudecken, sind weitere Studien erforderlich, um den entscheidenden Mechanismus der lateralen Größe von Graphenmaterialien zu veranschaulichen.

Ursprünge der GFN-Toxizität
Berichten zufolge beeinflussen die Eigenschaften von Graphen, einschließlich seiner Konzentration, lateralen Dimension, Oberflächenstruktur, funktionellen Gruppen, Reinheit und Proteinkorona, stark seine Toxizität in biologischen Systemen [2, 7, 104, 126–129].

Konzentration
Zahlreiche Ergebnisse haben gezeigt, dass Graphenmaterialien bei Tieren und Zellen eine dosisabhängige Toxizität verursachen, wie Leber- und Nierenschäden, Lungengranulombildung, verminderte Zelllebensfähigkeit und Zellapoptose [130–134]. In-vivo-Studien zeigte GO keine offensichtliche Toxizität bei Mäusen, die einer niedrigen Dosis (0,1 mg) und einer mittleren Dosis (0,25 mg) ausgesetzt waren, induzierte jedoch bei einer hohen Dosis (0,4 mg) eine chronische Toxizität. Der hohe Gehalt an GO lagerte sich hauptsächlich in Lunge, Leber, Milz und Niere ab und war durch eine einzelne Schwanzveneninjektion von den Nieren nur schwer zu reinigen [135]. Interessanterweise führte eine Erhöhung der Dosis zu einer dramatischen Abnahme der hepatischen Aufnahme, jedoch zu einer Zunahme der pulmonalen Aufnahme von s-GO durch intravenöse Injektion [31], da die hohe Dosis von GO möglicherweise die Aufnahmesättigung übertraf oder die Masse an Plasma-Opsoninen verringerte , die folglich die hepatische Aufnahme unterdrückt. Darüber hinaus wurde in einer In-vitro-Studie berichtet, dass 20 µg/mL GO-Nanosheets innerhalb von 2 h nach Inkubation keine Zytotoxizität in A549 zeigten, eine höhere Konzentration (85 µg/mL) jedoch die Zellviabilität innerhalb von 24 h auf 50 % verringerte [136, 137] . Lüet al. zeigten auch, dass GO bei niedrigen Konzentrationen 96 h lang keine offensichtliche Zytotoxizität in einer humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zelllinie aufwies, jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung mit 100 mg/ml GO für 96 h Inkubation stark auf 20 % abnahm [123] . Die Ergebnisse in HeLa-Zellen, NIH-3 T3-Zellen und Brustkrebszellen (SKBR3, MCF7), die mit Graphen-Nanobändern behandelt wurden, zeigten ebenfalls eine dosis- (10–400 mg/ml) und zeitabhängige (12–48 h) Abnahme der Zelllebensfähigkeit [138]. Zunehmende Konzentrationen von GO gelangten in die Lysosomen, Mitochondrien, das Endoplasma und den Zellkern [119]. Mehrere Daten deuteten darauf hin, dass rGO bei einer niedrigeren Dosis und zu einem frühen Zeitpunkt den Apoptose-vermittelten Zelltod verursachte, dass jedoch mit zunehmender Zeit/Dosis Nekrose vorherrschte [110, 135].

Seitenmaß
Nanopartikel mit einer Größe < 100 nm können in die Zelle gelangen, < 40 nm in den Zellkern und kleiner als < 35 nm können die Blut-Hirn-Schranke passieren [85]. Eine Studie zeigte, dass GO (588, 556, 148 nm) nicht in A549-Zellen eindrang und keine offensichtliche Zytotoxizität aufwies [112]. Wenn der Durchmesser von Graphen zwischen 100 ~ 500 nm liegt, kann die kleinste Größe die stärkste Toxizität verursachen, und wenn der Durchmesser unter 40 nm liegt, können die kleinsten Größen die sichersten sein. Beispielsweise könnte rGO mit einem Durchmesser von 11 ± 4 nm in den Kern der hMSCs eindringen und bei sehr niedrigen Konzentrationen von 0,1 und 1,0 mg/mL in 1 h Chromosomenaberrationen und DNA-Fragmentierung verursachen. rGO-Faltblätter mit Durchmessern von 3,8 ± 0,4 nm zeigten jedoch selbst bei einer hohen Dosis von 100 mg/ml nach 24 h keine nennenswerte Genotoxizität in hMSCs [118].

In einer In-vivo-Studie akkumulierte s-GO (100–500 nm) bevorzugt in der Leber, wohingegen l-GO (1–5 µm) hauptsächlich in der Lunge lokalisiert war, da l-GO größere GO-Proteinkomplexe bildete, die gefiltert wurden durch die pulmonalen Kapillargefäße nach intravenöser Injektion [31]. Angesichts der relativen lateralen Größen (205,8 nm, 146,8 nm und 33,78 nm) der drei GO-Nanoblätter bei gleicher Konzentration erfährt kleineres GO in Hela-Zellen eine viel größere Aufnahme als größeres GO [139]. Die hohe Aufnahme von s-GO veränderte sich in der Mikroumgebung der Zellen und induzierte folglich den größten Verlust der Lebensfähigkeit und den schwerwiegendsten oxidativen Stress unter drei Größen von GO-Proben [119]. Als Ergebnis zeigte eine Studie, dass GO größenabhängig die M1-Polarisierung von Makrophagen und proinflammatorische Reaktionen in vitro und in vivo induzierte. Größeres GO zeigte eine stärkere Adsorption an die Plasmamembran mit weniger Phagozytose, löste robuste Interaktionen mit TLRs aus und aktivierte NF-κB-Wege im Vergleich zu kleineren GO-Faltblättern, die eher von Zellen aufgenommen wurden [94]. Um den detaillierten Mechanismus, der diesen Effekten zugrunde liegt, aufzudecken, sind weitere Studien erforderlich, um den entscheidenden Mechanismus der lateralen Größe von Graphenmaterialien zu veranschaulichen.

Ursprünge der GFN-Toxizität
Berichten zufolge beeinflussen die Eigenschaften von Graphen, einschließlich seiner Konzentration, lateralen Dimension, Oberflächenstruktur, funktionellen Gruppen, Reinheit und Proteinkorona, stark seine Toxizität in biologischen Systemen [2, 7, 104, 126–129].

Konzentration
Zahlreiche Ergebnisse haben gezeigt, dass Graphenmaterialien bei Tieren und Zellen eine dosisabhängige Toxizität verursachen, wie Leber- und Nierenschäden, Lungengranulombildung, verminderte Zelllebensfähigkeit und Zellapoptose [130–134]. In-vivo-Studien zeigte GO keine offensichtliche Toxizität bei Mäusen, die einer niedrigen Dosis (0,1 mg) und einer mittleren Dosis (0,25 mg) ausgesetzt waren, induzierte jedoch bei einer hohen Dosis (0,4 mg) eine chronische Toxizität. Der hohe Gehalt an GO lagerte sich hauptsächlich in Lunge, Leber, Milz und Niere ab und war durch eine einzelne Schwanzveneninjektion von den Nieren nur schwer zu reinigen [135]. Interessanterweise führte eine Erhöhung der Dosis zu einer dramatischen Abnahme der hepatischen Aufnahme, jedoch zu einer Zunahme der pulmonalen Aufnahme von s-GO durch intravenöse Injektion [31], da die hohe Dosis von GO möglicherweise die Aufnahmesättigung übertraf oder die Masse an Plasma-Opsoninen verringerte , die folglich die hepatische Aufnahme unterdrückt. Darüber hinaus wurde in einer In-vitro-Studie berichtet, dass 20 µg/mL GO-Nanosheets innerhalb von 2 h nach Inkubation keine Zytotoxizität in A549 zeigten, eine höhere Konzentration (85 µg/mL) jedoch die Zellviabilität innerhalb von 24 h auf 50 % verringerte [136, 137] . Lüet al. zeigten auch, dass GO bei niedrigen Konzentrationen 96 h lang keine offensichtliche Zytotoxizität in einer humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zelllinie aufwies, jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung mit 100 mg/ml GO für 96 h Inkubation stark auf 20 % abnahm [123] . Die Ergebnisse in HeLa-Zellen, NIH-3 T3-Zellen und Brustkrebszellen (SKBR3, MCF7), die mit Graphen-Nanobändern behandelt wurden, zeigten ebenfalls eine dosis- (10–400 mg/ml) und zeitabhängige (12–48 h) Abnahme der Zelllebensfähigkeit [138]. Zunehmende Konzentrationen von GO gelangten in die Lysosomen, Mitochondrien, das Endoplasma und den Zellkern [119]. Mehrere Daten deuteten darauf hin, dass rGO bei einer niedrigeren Dosis und zu einem frühen Zeitpunkt den Apoptose-vermittelten Zelltod verursachte, dass jedoch mit zunehmender Zeit/Dosis Nekrose vorherrschte [110, 135].

Seitenmaß
Nanopartikel mit einer Größe < 100 nm können in die Zelle gelangen, < 40 nm in den Zellkern und kleiner als < 35 nm können die Blut-Hirn-Schranke passieren [85]. Eine Studie zeigte, dass GO (588, 556, 148 nm) nicht in A549-Zellen eindrang und keine offensichtliche Zytotoxizität aufwies [112]. Wenn der Durchmesser von Graphen zwischen 100 ~ 500 nm liegt, kann die kleinste Größe die stärkste Toxizität verursachen, und wenn der Durchmesser unter 40 nm liegt, können die kleinsten Größen die sichersten sein. Beispielsweise könnte rGO mit einem Durchmesser von 11 ± 4 nm in den Kern der hMSCs eindringen und bei sehr niedrigen Konzentrationen von 0,1 und 1,0 mg/mL in 1 h Chromosomenaberrationen und DNA-Fragmentierung verursachen. rGO-Faltblätter mit Durchmessern von 3,8 ± 0,4 nm zeigten jedoch selbst bei einer hohen Dosis von 100 mg/ml nach 24 h keine nennenswerte Genotoxizität in hMSCs [118].

In einer In-vivo-Studie akkumulierte s-GO (100–500 nm) bevorzugt in der Leber, wohingegen l-GO (1–5 µm) hauptsächlich in der Lunge lokalisiert war, da l-GO größere GO-Proteinkomplexe bildete, die gefiltert wurden durch die pulmonalen Kapillargefäße nach intravenöser Injektion [31]. Angesichts der relativen lateralen Größen (205,8 nm, 146,8 nm und 33,78 nm) der drei GO-Nanoblätter bei gleicher Konzentration erfährt kleineres GO in Hela-Zellen eine viel größere Aufnahme als größeres GO [139]. Die hohe Aufnahme von s-GO veränderte sich in der Mikroumgebung der Zellen und induzierte folglich den größten Verlust der Lebensfähigkeit und den schwerwiegendsten oxidativen Stress unter drei Größen von GO-Proben [119]. Als Ergebnis zeigte eine Studie, dass GO größenabhängig die M1-Polarisierung von Makrophagen und proinflammatorische Reaktionen in vitro und in vivo induzierte. Größeres GO zeigte eine stärkere Adsorption an die Plasmamembran mit weniger Phagozytose, löste robuste Interaktionen mit TLRs aus und aktivierte NF-κB-Wege im Vergleich zu kleineren GO-Faltblättern, die eher von Zellen aufgenommen wurden [94]. Um den detaillierten Mechanismus, der diesen Effekten zugrunde liegt, aufzudecken, sind weitere Studien erforderlich, um den entscheidenden Mechanismus der lateralen Größe von Graphenmaterialien zu veranschaulichen.

Oberflächenstruktur
GFNs besitzen sehr unterschiedliche Oberflächenchemien. Zum Beispiel ist die unberührte Graphenoberfläche hydrophob, die GO-Oberfläche ist mit Carboxylatgruppen teilweise hydrophob [140–142] und rGO hat eine mittlere Hydrophilie [143]. Es wurde beobachtet, dass GFNs die Funktion und Struktur von Zellmembranen und Proteinen wahrscheinlich durch außergewöhnlich starke molekulare Interaktionen mit Zellen stören [2, 91]. Beispielsweise bindet rGO an Zellmembranen, stimuliert Rezeptoren und aktiviert mitochondriale Signalwege, wodurch Apoptose induziert wird [110, 111, 144]. Begrenzte Beweise zeigten, dass GO aufgrund des hohen Sauerstoffgehalts, der glatteren Kanten und der hydrophilen Eigenschaften der ersteren Spezies kleiner und weniger toxisch als rGO ist [104, 145, 146]. Aufgrund der unterschiedlichen Oberflächenoxidationsstufen von GO und rGO könnte GO, das eine unterschiedliche Hydrophilie besitzt, leicht von HepG2-Zellen internalisiert und aufgenommen werden. Im Gegensatz dazu konnte rGO mit offensichtlicher Hydrophobie ohne (oder mit geringerer) Aufnahme an Zelloberflächen adsorbiert und aggregiert werden [110]. Aufgrund der starken π-π-Stapelwechselwirkungen ist Graphen in der Lage, viele Reste des Proteins zu brechen, insbesondere die aromatischen, wie das Villin-Kopfstück (HP), F10, W23 und F35. Die Sekundär- und Tertiärstrukturen des Proteins liegen größtenteils auf der Graphenoberfläche und stören die Struktur und Funktion des Proteins [41] (Abb. 2). Außerdem kann GO zwischen die Basenpaare doppelsträngiger DNA inserieren und den genetischen Informationsfluss auf molekularer Ebene stören, was eine der Hauptursachen für die mutagene Wirkung von GO sein könnte [7, 112, 146, 147] .

Abb. 2
Figur 2
Eine repräsentative Trajektorie von HP35, die an Graphen adsorbiert. (a) Repräsentative Momentaufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Proteine ​​sind in Cartoons mit roter Helix und grüner Schleife dargestellt, und das Graphen ist in Weizen dargestellt. Die aromatischen Reste, die die π-π-Stapelwechselwirkungen bilden, sind in Blau dargestellt, andere in Grün. (b) Die Kontaktfläche von HP35 mit dem Graphen. (c) Die RMSD von HP35 aus seiner nativen Struktur und der Anzahl der Reste in der α-Helix-Struktur. Hier werden die Sekundärstrukturen vom DSSP-Programm bestimmt. (d) Der Abstand zwischen dem Graphen und den aromatischen Resten, einschließlich F35, W23, F10, F17 und F06. Um den Adsorptionsprozess klarer darzustellen, wurde die χ-Achse abgeschnitten und neu skaliert. [41] Copyright (2011), mit Genehmigung von Journal of Physical of Chemistry

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Eine Reihe von Studien haben die Bedeutung der GO-Oberflächenladung aufgrund ihrer Fähigkeit, den Internalisierungs- und Aufnahmemechanismus von Zellen zu beeinflussen, hervorgehoben [148–150]. Die Internalisierung von GO war in Nicht-Phagozyten vernachlässigbar, was wahrscheinlich auf die starke elektrostatische Abstoßung zwischen dem negativ geladenen GO und der Zelloberfläche zurückzuführen war [34]. Andere haben jedoch vorgeschlagen, dass negativ geladene Nanopartikel in nicht-phagozytische Zellen internalisiert werden können, indem sie an verfügbare kationische Stellen auf der Zelloberfläche binden und von Scavenger-Rezeptoren aufgenommen werden [110, 146, 150]. Berichten zufolge verursachen GO/GS-Partikel morphologische Veränderungen und eine signifikante Lyse, was zu einer hohen Hämolyse in roten Blutkörperchen (RBCs) führt. Die Zerstörung der RBC-Membran wird wahrscheinlich auf die starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den negativ geladenen Sauerstoffgruppen auf der GO/GS-Oberfläche und positiv geladenen Phosphatidylcholin-Lipiden auf der RBC-Außenmembran zurückgeführt [106].

Funktionalisierung
Studien bestätigten, dass die Funktionalisierung mit PEG [52], PEGyliertem Poly-L-Lysin (PLL) [151], Poly(ε-caprolacton) [152], Polyvinylalkohol [3], Pluronic [153], Amin [98], Carboxyl , und Dextran [79]-Gruppen verringert die Toxizität stark und verbessert die Biokompatibilität von Graphen. In-vivo-Ergebnisse zeigten, dass nach der subkutanen Injektion von GO-Pluronic Hydrogel nur eine leichte chronische Entzündung auftrat und nach der intravenösen Injektion von GO-DEX keine merkliche Kurzzeittoxizität getestet wurde [79, 154]. PEGyliertes GS induzierte keine nennenswerte Toxizität bei Mäusen, die 3 Monate lang gegen 20 mg/kg exponiert wurden, wie durch Blutbiochemie und histologische Untersuchungen bewertet wurde, und zeigte eine relativ geringe Retention im RES [52, 155]. Die Beschichtung von GO mit Chitosan eliminierte fast die hämolytische Aktivität im Blut [39]. Darüber hinaus linderte die PEG-Beschichtung wirksam GO-induzierte akute Gewebeverletzungen; verminderte GO-Aggregation und -Retention in Leber, Lunge und Milz; und förderte die Clearance von GO [81], GO-DEX [79] und fluoriertem Graphenoxid (FGO) [156].

In vitro zeigten mehrere Zellfunktionsassays klare Hinweise darauf, dass die Oberflächenfunktionalisierung von reinem Graphen oder GO entscheidend für die Reduzierung der starken Toxizitätseffekte war [91]. PEG-GO, PEI-GO und LA-PEG-GO schädigten menschliche Lungenfibroblastenzellen weniger als GO [148]. PEG-GO zeigte keine Zytotoxizität gegenüber mehreren Zellkulturen wie Glioblastomzellen (U87MG), Brustkrebszellen (MCF-7), menschlichen Ovarialkarzinomzellen (OVCAR-3), Dickdarmkrebszellen (HCT-116) und lymphoblastoiden Zellen (RAJI), in Konzentrationen bis 100 µg/ml [119, 157, 158]. GQDs-PEG zeigte selbst bei sehr hohen Konzentrationen (200 µg/ml) eine sehr geringe oder keine Toxizität gegenüber Lungen- und Gebärmutterhalskrebszellen [159]. Da es sich jedoch um ein nicht biologisch abbaubares Material mit großem Potenzial zur zellulären Internalisierung handelt, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die möglichen langfristigen Nebenwirkungen von funktionalisiertem Graphen zu bewerten.

Aggregationen und Sedimentation
Berichten zufolge neigen Nanomaterialien dazu, eher Aggregate als einzelne Einheiten zu bilden, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. GS-Oberflächen ließen im Vergleich zu GO weniger Erythrozyten anheften, und GS hatte die geringere hämolytische Aktivität für die Bildung von mehr wässrigen Aggregaten. Im Gegensatz dazu hemmte die schnelle Sedimentation und Aggregatbildung von GS die Nährstoffverfügbarkeit von menschlichen Hautfibroblastenzellen, die auf dem Boden von Wells gezüchtet wurden [106]. Daher üben die Aggregationen und Sedimentation von Graphenpartikeln unterschiedliche Wirkungen auf verschiedene Zellen aus.

Verunreinigungen
Die Reinheit des Nanomaterials ist ein wichtiger Aspekt, da verbleibende kontaminierende Metalle für die beobachtete Toxizität verantwortlich sein können und nicht das Nanomaterial selbst, was zu widersprüchlichen Daten zur Zytotoxizität von GFNs geführt hat [35, 160]. Herkömmlich hergestelltes GO enthält oft hohe Mengen an Mn2+ und Fe2+, die für Zellen stark mutagen sind. Die unspezifische Freisetzung dieser Ionen aus traditionell hergestelltem GO könnte zu ungewöhnlich hohen Zytotoxizitäten und DNA-Frakturen führen [39]. Insbesondere Peng et al. [161] produzierten hochreines GO mit nur 0.025 ppm Mn2+ und 0.13 ppm Fe2+, und Hanene et al. [162] erfanden eine neue Methode zur Herstellung hochreiner einschichtiger GO-Schichten mit guter wässriger Dispergierbarkeit und kolloidaler Stabilität. Mit diesen neuen Methoden hergestelltes GO induzierte in vitro keine signifikanten zytotoxischen Reaktionen (bei Expositionsdosen von bis zu 100 µg/ml), und in vivo wurde keine offensichtliche Entzündungsreaktion oder Granulombildung (Expositionsdosen bis zu 50 µg/Tier) beobachtet. Daher verdient die Reinheit von GFNs Aufmerksamkeit und ist ein wichtiger Schritt zur Bestimmung von GFNs, die an Bioanwendungen beteiligt sind.

Protein-Corona-Effekt
Aufgrund der hohen freien Oberflächenladung können Nanomaterialien mit Proteinen in biologischen Systemen leicht „Coronas“ bilden [163, 164]. Es wird vermutet, dass die Proteinkorona die Zirkulation, Verteilung, Clearance und Toxizität von Nanopartikeln beeinflusst. Mehrere Veröffentlichungen berichteten, dass GO mit adsorbierten Plasmaproteinen im Serum GO-Protein-Coronas bildet und diese GO-Protein-Coronas eine wichtige Rolle bei der Entscheidung über das Schicksal des biokinetischen Verhaltens von GO in vivo spielen. Solche GO-Protein-Coronas können die Adhäsion von GO an Endothel- und Immunzellen sowohl durch spezifische als auch durch unspezifische Wechselwirkungen regulieren [165]. Grundsätzlich helfen Immunglobulin G und Komplementproteine ​​in der Proteinkorona, Nanopartikel in Immunzellen zu reorganisieren, wodurch die Partikel vom RES verschlungen werden, und IgG-beschichtetes GO wurde entweder durch spezifische oder unspezifische Interaktionen mit Zellmembranrezeptoren aufgenommen [31, 165]. Eine andere Studie ergab jedoch, dass GO nicht direkt im Darmtrakt an Schleimhautepithelzellen anhaften konnte, nachdem die Filialmäuse eine wässrige GO-Lösung getrunken hatten, da reichlich Proteine ​​in der Milch an der Oberfläche des GO adsorbiert waren und somit deren direkte Wechselwirkung mit dem Schleimhautepithelzellen [53]. Proteinkorona milderte die Zytotoxizität von GO, indem sie seine physikalische Wechselwirkung mit der Zellmembran begrenzte und die zellmorphologische Schädigung in HeLa-, THP-1- und A549-Zellen reduzierte [166–168]. Die zytotoxische Wirkung wurde stark reduziert, wenn GO mit FBS vorbeschichtet und mit Zellen inkubiert wurde; Fast  ∼ 90 % Überleben wurde mit 100 µg/ml FBS-beschichtetem GO und 100 % Überleben mit 20 µg/ml FBS-beschichtetem GO beobachtet. Ähnliche Trends wurden für GO beobachtet, das von BSA abgedeckt wird [166, 169]. Konsequenterweise könnte zusätzliches Serum die Toxizität von reinem GO in J774.A1-Zellen in einer Dosis von 4 µg/ml neutralisieren, was zu einer Abnahme der Zellzahl um 52,5 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen führte [89].

Nach Durchsicht vieler Studien kann der Schluss gezogen werden, dass die Toxizität von Graphen von mehreren Faktoren beeinflusst wird. Diese Faktoren kombinierten die Toxizität von GFNs in vielen Fällen stark. Wissenschaftliche Studien erfordern oft die eindeutige Identifizierung von Ursache und Wirkung, wobei jeweils nur ein Faktor unterschiedlich sein sollte, damit die Wirkung dieses einzelnen Faktors bestimmt werden kann. In einigen Veröffentlichungen wurden jedoch mehrere Faktoren, die die Toxizität von GFNs beeinflussen, gleichzeitig untersucht, was zu verwirrenden Ergebnissen führte.

Mögliche Toxizitätsmechanismen von GFNs
Obwohl einige physikalisch-chemische Eigenschaften und die Toxizität von GFNs von vielen Wissenschaftlern gut untersucht wurden, bleiben die genauen Mechanismen, die der Toxizität von GFNs zugrunde liegen, unklar. Eine schematische Darstellung der Hauptmechanismen der Zytotoxizität von GFNs ist in Abb. 3 dargestellt.

Physische Zerstörung
Graphen ist im Vergleich zu anderen kugelförmigen oder eindimensionalen Nanopartikeln aufgrund seiner zweidimensionalen Struktur mit sp2-Kohlenstoffen ein einzigartiges Nanomaterial. Die physikalische Wechselwirkung von Graphen-Nanopartikeln mit Zellmembranen ist eine der Hauptursachen für die Zytotoxizität von Graphen [7, 170, 171]. Graphen hat aufgrund seiner günstigen Oberflächenkrümmung eine hohe Fähigkeit, an die α-helikalen Strukturen von Peptiden zu binden [172]. Bei Konzentrationen über 75 µg/ml haftete reines Graphen weitgehend an der Oberfläche von RAW 264.7-Zellen und führte zu einer abnormalen Dehnung der Zellmembran [104]. Die starken hydrophoben Wechselwirkungen von GFNs mit der Zellmembran führen zur morphologischen Erweiterung der filopodialen und zytoskelettalen F-Aktin-Dysfunktion. Darüber hinaus können die scharfen Kanten von GNS als „Klingen“ fungieren, die bakterielle Zellmembranen einführen und durchschneiden [173]. Darüber hinaus schädigte GO auch direkt die äußere Membran von E. coli-Bakterien, was zur Freisetzung intrazellulärer Komponenten führte [173]. Die TEM-Bildgebung zeigte jedoch, dass die Vorbeschichtung von GO mit FBS die Zerstörung von Zellmembranen beseitigte [166].

ROS-Produktion führt zu oxidativem Stress
Oxidativer Stress entsteht, wenn steigende ROS-Spiegel die Aktivität antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD oder Glutathionperoxidase (GSH-PX) überfordern [174]. ROS wirken als Second Messenger in vielen intrazellulären Signalkaskaden und führen zu zellulären makromolekularen Schäden wie Membranlipidabbau, DNA-Fragmentierung, Proteindenaturierung und mitochondrialer Dysfunktion, die den Zellstoffwechsel und die Signalübertragung stark beeinflussen [175–177]. Die Interaktionen von GO mit Zellen können zu einer übermäßigen ROS-Erzeugung führen, die den ersten Schritt in den Mechanismen der Karzinogenese, Alterung und Mutagenese darstellt [83, 122]. Oxidativer Stress spielte eine signifikante Rolle bei der GO-induzierten akuten Lungenschädigung [30], und die durch oxidativen Stress verursachten Entzündungsreaktionen traten oft bei Exposition gegenüber GFNs auf [133, 177, 178]. Die Aktivität von SOD und GSH-PX nahm nach Exposition gegenüber GO zeit- und dosisabhängig ab [82, 106, 119]. Ebenso war oxidativer Stress die Hauptursache für Apoptose und DNA-Schäden, nachdem HLF-Zellen GO ausgesetzt wurden [148]. Sowohl die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) (JNK, ERK und p38) als auch die TGF-beta-bezogenen Signalwege wurden durch die ROS-Erzeugung in reinen Graphen-behandelten Zellen ausgelöst, begleitet von der Aktivierung von Bim und Bax, zwei Pro -apoptotische Mitglieder der Bcl-2-Proteinfamilie. Dadurch wurden Caspase-3 und seine nachgeschalteten Effektorproteine ​​wie PARP aktiviert und die Apoptose initiiert [83, 179]. Detaillierte Informationen zu den MAPK-, TGF-β- und TNF-α-bezogenen Signalwegen, die Entzündungen, Apoptose und Nekrose induzieren, sind in Abb. 4 zusammengefasst.

Abb. 4
 

Mitochondriale Schäden
Mitochondrien sind Energieproduktionszentren, die an verschiedenen Signalwegen in Zellen beteiligt sind und auch ein Schlüsselpunkt der apoptotischen Regulation sind [83]. Nach Exposition gegenüber GO und Carboxylgraphen (GXYG) war die Mitochondrienmembran depolarisiert und die Menge an Mitochondrien nahm in HepG2-Zellen ab [180]. Die Exposition gegenüber GFNs führte zu einem signifikant erhöhten gekoppelten und ungekoppelten mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, einer Dissipation des mitochondrialen Membranpotentials und schließlich einer Auslösung der Apoptose durch die Aktivierung des mitochondrialen Signalwegs [181]. Beispielsweise erhöhte GO die Aktivität der mitochondrialen Elektronentransportkomplexe I/III und die Zufuhr von Elektronen zu den Stellen I/II der Elektronentransportkette, wodurch die Bildung von ROS während der mitochondrialen Atmung in MHS-Zellen beschleunigt wurde [99]. Die durch GO und das Cytochrom-c/H2O2-Elektronentransfersystem vermittelte Bildung von •OH könnte oxidativen und thermischen Stress verstärken, das mitochondriale Atmungssystem beeinträchtigen und schließlich zu einer dramatischen Toxizität führen [151]. Darüber hinaus könnten die Sauerstoffeinheiten von GO Elektronen von zellulären Redoxproteinen aufnehmen, was den Redoxzyklus von Cytochrom c und Elektronentransportproteinen unterstützt, und die Cytochrome MtrA, MtrB und MtrC/OmcA könnten an der Übertragung von Elektronen auf GO beteiligt sein [182]. Daher können GFNs mit Ausnahme der Plasmamembranschädigung und der Induktion von oxidativem Stress Apoptose und/oder Zellnekrose verursachen, indem sie die mitochondriale Zellaktivität direkt beeinflussen [183, 184].

DNA-Schäden
Aufgrund seiner geringen Größe, großen Oberfläche und Oberflächenladung kann GO signifikante genotoxische Eigenschaften besitzen und schwere DNA-Schäden verursachen, zum Beispiel Chromosomenfragmentierung, DNA-Strangbrüche, Punktmutationen und oxidative DNA-Addukte und -Veränderungen [87, 122, 185 , 186]. Mutagenese wurde bei Mäusen nach intravenöser Injektion von GO in einer Dosis von 20 mg/kg im Vergleich zu Cyclophosphamid (50 mg/kg), einem klassischen Mutagen, beobachtet [112]. Auch wenn GO nicht in den Zellkern eindringen kann, kann es dennoch während der Mitose mit der DNA interagieren, wenn die Kernmembran zerfällt, was die Möglichkeit für DNA-Aberrationen erhöht [87, 147, 187, 188]. Die π-Stacking-Wechselwirkung zwischen den Kohlenstoffringen des Graphens und den hydrophoben DNA-Basenpaaren kann dazu führen, dass ein DNA-Segment auf der Oberfläche von Graphen „aufsteht“ oder „aufliegt“, wobei seine Helixachse senkrecht bzw. parallel ist. Die intermolekularen Kräfte verformen die endständigen Basenpaare der DNA stark, was die Genotoxizität potenziell erhöht [189]. GO kann auch chromosomale Fragmentierung, DNA-Addukte und Punktmutationen induzieren, indem es oxidativen Stress fördert oder Entzündungen durch die Aktivierung intrazellulärer Signalwege wie MAPK, TGF-β und NF-κB auslöst [110, 112, 146]. Graphen und rGO können auch die Expression von p53, Rad51 und MOGG1-1 erhöhen, was Chromosomenschäden widerspiegelt, und die Expression von CDK2 und CDK4 verringern, indem sie den Zellzyklusübergang von der G1- zur S-Phase in verschiedenen Zelllinien stoppen [112 ]. DNA-Schäden können nicht nur die Krebsentstehung initiieren, sondern möglicherweise auch die Gesundheit der nächsten Generation bedrohen, wenn das mutagene Potenzial von GO in Fortpflanzungszellen auftritt, was die Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen beeinflusst [112, 190].

Entzündungsreaktion
GFNs können in hohen Dosen durch intratracheale Instillation oder intravenöse Verabreichung eine signifikante Entzündungsreaktion einschließlich Entzündungszellinfiltration, Lungenödem und Granulombildung verursachen [30, 49]. Thrombozyten sind die wichtigen Komponenten bei der Gerinnselbildung, um Krankheitserreger und Partikel während der Entzündungsreaktion anzugreifen, und GO könnte direkt die Bildung von plättchenreichen Thromben aktivieren, um Lungengefäße nach intravenöser Injektion zu verschließen [98, 191]. Durch die subkutane Injektion von GO über 21 Tage wurde eine starke Entzündungsreaktion induziert, zusammen mit der Sekretion von Schlüsselzytokinen, einschließlich IL-6, IL-12, TNF-α, MCP-1 und IFN-g [34, 192]. GFNs können eine Entzündungsreaktion und Gewebeschädigung auslösen, indem sie Zytokine und Chemokine freisetzen, die zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten führen und die Sekretion von Th1/Th2-Zytokinen und Chemokinen stimulieren [124, 193]. Darüber hinaus rufen reines Graphen [193] und rGO [110] eine Entzündungsreaktion hervor, indem sie an Toll-like-Rezeptoren (TLRs) binden und den NF-κB-Signalweg in Zellen aktivieren. Die NF-κB-Signalkaskade wird durch TLRs und proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNF-α ausgelöst. Bei Aktivierung verschiebt sich NF-κB vom Zytoplasma in den Zellkern, erleichtert die Bindung von abbauendem IκB und wirkt als Transkriptionsfaktor zur Synthese zahlreicher proinflammatorischer Zytokine [194]. Eine schematische Darstellung des Signalweges von TLR4 und TLR9, die durch GFNs aktiviert werden, ist in Abb. 5 gezeigt.

Apoptose
Apoptose ist definiert als die Selbstzerstörung einer Zelle, die von Genen durch komplizierte Programme reguliert wird [83, 195]. GO und rGO verursachten in der Lunge von Mäusen nach Inhalation Apoptose und Entzündung [99], und GFNs hatten auch pro-apoptotische Wirkungen in Zellen [111, 113, 124, 196]. Darüber hinaus schädigten Graphen und GO physikalisch Zellmembranen [166], erhöhten die Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran und veränderten das mitochondriale Membranpotential; die erhöhte ROS löste die MAPK- und TGF-β-Signalwege aus und aktivierte Caspase-3 über mitochondrial-abhängige apoptotische Kaskaden, was zur Ausführung der Apoptose führte [83, 99]. In ähnlicher Weise verursachte rGO bei niedriger Dosis und zu einem frühen Zeitpunkt Apoptose, ausgelöst durch den Todesrezeptor und den kanonischen mitochondrialen Signalweg [110]. Eine andere Studie zeigte drei verschiedene Apoptosewege durch GFNs: GO führte durch direkte Interaktion mit Proteinrezeptoren und anschließende Aktivierung des B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2) Wegs zu ROS-abhängiger Apoptose; GO-COOH übertrug ein passives Apoptosesignal an nukleäre DNA, indem es an Proteinrezeptoren bindet und einen ROS-unabhängigen Signalweg aktiviert; GO-PEI schädigte jedoch die Membranen von T-Lymphozyten schwer, um Apoptose auszulösen [105, 197].

Autophagie
Autophagie ist der Prozess des Selbstabbaus von Zellbestandteilen und wurde kürzlich als nicht apoptotischer Zelltod anerkannt [198–200]. Die Autophagie-Aktivierung erfordert die Bildung von Autophagosomen, die Beclin 1, mehrere Autophagie-verwandte Proteine ​​(ATG), Mikrotubuli-assoziierte Protein-Leichtkette 3 (LC3) und p62 enthalten [201]. Die Akkumulation von Autophagosomen ist mit der Exposition gegenüber verschiedenen Nanopartikeln verbunden [202–205], und Autophagie kann extrazelluläre Organismen entfernen und die Organismen im Zytosol zerstören [206]. Es wurde gezeigt, dass GO und GQDs die Akkumulation von Autophagosomen und die Umwandlung von LC3-I in LC3-II induzieren; hemmen den Abbau des autophagischen Substrats p62 Protein [207, 208]. Darüber hinaus kann GO gleichzeitig TLR4- und TLR9-Antworten in Makrophagen [34, 192] und Dickdarmkrebszellen CT26 [206] auslösen. Der Autophagie-Weg ist durch TLR-Signalgebung in Makrophagen mit der Phagozytose verbunden [206, 209].

Nekrose
Nekrose ist eine alternative Form des Zelltods, die durch Entzündungsreaktionen oder Zellverletzungen induziert wird. Die Exposition von Zellen gegenüber reinem Graphen verursacht in hohen Dosen (50 mg/ml) Apoptose und Nekrose [83]. Berichten zufolge führen LDH-Leckage und die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore, die durch einen erhöhten Gehalt an zytoplasmatischem Ca2+ induziert wird, zu Apoptose/Nekrose [210]. Es wurde gezeigt, dass die GO-Behandlung eine makrophagische Nekrose induziert, indem sie die TLR4-Signalgebung aktiviert und anschließend teilweise die autokrine TNF-α-Produktion auslöst [93]. GO in Kombination mit CDDP (GO/CDDP) löste Nekrosen durch Verminderung von RIP1- und Erhöhung von RIP3-Proteinen aus, begleitet von der Freisetzung der Gruppe B1 mit hoher Mobilität (HMGB1) in das Zytosol aus dem Zellkern und aus CT26-Zellen [205, 211, 212].

Epigenetische Veränderungen
Epigenetik umfasst DNA-Methylierung, genomische Prägung, maternale Effekte, Gen-Silencing und RNA-Editierung [213–215]. Die DNA-Methylierung, die eine der am besten untersuchten epigenetischen Modifikationen ist, umfasst Phosphorylierung, Ubiquitinierung und ATP-Ribosylierung und kann zu einem Chromatin-Remodeling führen [197, 216, 217]. Eine kürzlich veröffentlichte Veröffentlichung berichtete, dass die Exposition gegenüber SL-GO/FL-GO zu einer globalen DNA-Hypermethylierung durch Hochregulierung der DNMT3B- und MBD1-Gene führte; Die GNP-Behandlung verursachte eine Hypomethylierung, indem sie die Expression der DNMT3B- und MBD1-Gene verringerte [216]. GO könnte den miRNA-360-Regulationsweg aktivieren, um die DNA-Schadens-Apoptose-Signalkaskade zu unterdrücken, indem es die Komponente von CEP-1 beeinflusst [218]. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass GFNs durch Modulation epigenetischer Veränderungen subtile Veränderungen in der Genexpressionsprogrammierung verursachen könnten. Es gibt jedoch nur wenige Studien zu GFN-induzierten epigenetischen Veränderungen, und der epigenetische Mechanismus, der durch GFNs-Exposition verursacht wird, ist nicht vollständig verstanden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass viele Studien repräsentative Mechanismen der GFN-Toxizität diskutiert haben, die vier Signalwege beinhalten: TLRs, TGF-β, TNF-α und MAPKs. Diese vier Signalwege sind korrelativ und kreuzmodulierend, wodurch die Entzündungsreaktion, Autophagie, Apoptose und andere Mechanismen unabhängig und doch miteinander verbunden sind. Darüber hinaus scheint oxidativer Stress die wichtigste Rolle bei der Aktivierung dieser Signalwege zu spielen. Es wurde berichtet, dass es in den Studien zur Toxizität anderer Nanomaterialien Überschneidungen von Apoptose, Autophagie und Nekrose gibt, sie hemmen oder fördern sich unter bestimmten Bedingungen gegenseitig. Die bisher in Veröffentlichungen untersuchten Signalwege der GFN-Toxizität sind jedoch nur ein kleiner Teil eines komplizierten Netzes, und das Netzwerk der Signalwege muss in Zukunft im Detail erforscht werden.

Datenlücken und zukünftige Studien
Derzeit reicht die Literatur nicht aus, um Rückschlüsse auf die potentiellen Gefahren von GFNs zu ziehen. Es haben sich zwei gegensätzliche Meinungen herausgebildet: Einige Forscher schlugen in einer Reihe von Studien mit Schwerpunkt auf biomedizinischen Anwendungen vor, dass Graphenmaterialien biokompatibel sind [119, 154, 162, 219], und andere Studien berichteten über nachteilige biologische Reaktionen und Zytotoxizität [32, 118, 135 , 138, 192]. Diese inkonsistenten Ergebnisse könnten durch mehrere Faktoren verursacht worden sein, darunter die verschiedenen Forschungsgruppen, verschiedene Zell- oder Tiermodelle und unterschiedliche physikalisch-chemische Charakterisierungen von GFNs. Wenn GFNs für in-vivo-Anwendungen im menschlichen Körper oder einige andere biomedizinische Anwendungen erforscht werden, muss die Biokompatibilität berücksichtigt werden, und es sind detailliertere und genauere Studien zur Toxizität von GFNs erforderlich.

Erstens ist eine detaillierte physikalisch-chemische Charakterisierung für alle zukünftigen Studien zur Toxizität von GFNs unerlässlich. In den Experimenten sollten die Merkmalsbeschreibungen von GFNs ihre Größe, Morphologie, Oberfläche, Ladung, Oberflächenmodifikationen, Reinheit und Agglomeration umfassen [88, 141, 148, 162]. Da diese physikalisch-chemischen Faktoren die Toxizität und Biokompatibilität von GFNs stark beeinflussen, sollte ein einfaktorielles Versuchsdesign und der Ausschluss anderer Störfaktoren in Betracht gezogen werden. Details zum Herstellungsprozess sollten ebenfalls angegeben werden, da die gebildeten oxidativen Debris die Oberflächenstruktur von Graphen und GO während der Funktionalisierung stark verändern könnten [151]. Wichtig ist, dass in der Graphentechnologie eine einzige, universelle Methode etabliert werden muss, die einen besseren Vergleich von Daten aus verschiedenen Studien oder verschiedenen Labors ermöglicht.

Zweitens können unterschiedliche Beobachtungskriterien, Parameter und die Auswahl experimenteller Methoden zu großen Variationen zwischen den Labors führen [220, 221]. Beispielsweise kann der MTT-Assay die Graphen-Toxizität immer nicht genau vorhersagen, da die spontane Reduktion zu einem falsch positiven Signal führt. Daher sollten geeignete alternative Bewertungen verwendet werden, wie das wasserlösliche Tetrazoliumsalz-Reagenz (WST-8), der ROS-Assay und der Trypanblau-Ausschlusstest [106, 222]. Darüber hinaus zeigt der Comet-Assay häufig höhere DNA-Schäden als der Mikronukleus-Assay, da ersterer die reparierbare Verletzung und letzterer den nach der Zellteilung verbleibenden Genschaden misst [159, 223]. Daher ist bei der Auswahl des am besten geeigneten Assays zur Bewertung der Toxizität von Graphenmaterialien Vorsicht geboten, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden.

Drittens ist die Auswahl von Zelllinien von entscheidender Bedeutung, da Krebszelllinien abhängig von ihrem genetischen Hintergrund dazu neigen, empfindlich oder resistent zu sein. Dieselben Graphen-Nanopartikel können je nach ihrer unterschiedlichen Zellherkunft unterschiedliche Reaktionen hervorrufen. Es müssen geeignete Zelllinien mit guter Stabilität verwendet werden, um falsch positive oder negative Ergebnisse zu vermeiden. Von Menschen oder Tieren stammende Primärzellen können den Gesundheitszustand des Menschen besser simulieren. Eine große Menge an Primärzellen wurde verwendet, um die Toxizität anderer Nanomaterialien zu testen [224–228], aber die Kultivierung von Primärzellen ist in den bisherigen Experimenten mit GFNs äußerst selten [210, 229]. Um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Toxizität von GFNs umfassend zu bewerten, sollten verschiedene Zellexperimente in Kombination mit Primärzellen durchgeführt werden.

Viertens spielt der Verabreichungsweg von GFNs eine sehr wichtige Rolle in Toxizitätsstudien, und unterschiedliche Verabreichungsmethoden führen zu unterschiedlichen toxikologischen Reaktionen [32, 53]. Daher sollten Art und Dauer der Exposition entsprechend dem Ziel der Studie sorgfältig ausgewählt werden. Zur Untersuchung der Neurotoxizität von Nanomaterialien wird häufig die nasale Wirkstoffabgabe verwendet [230, 231], diese Verabreichungsmethode wurde jedoch selten bei der Prüfung der Toxizität von GFNs angewendet. Toxikologische Studien zu GFNs im Nervensystem sind selten, und der Mechanismus ist unklar und muss in Zukunft weiter untersucht werden. Kürzlich durchgeführte toxikokinetische Studien zur Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung, Akkumulation und Ausscheidung von GFNs über verschiedene Expositionswege haben einige Ergebnisse geliefert, reichen jedoch bei weitem nicht aus, um die internen komplexen Mechanismen aufzuklären. Zum Beispiel sind weitere Studien erforderlich, um die spezifischen molekularen Mechanismen von GFNs, die die physiologischen Barrieren passieren, und die Menge der Akkumulation oder die Ausscheidungszeit von GFNs im Gewebe zu verstehen. Darüber hinaus ist angesichts der erhöhten Exposition des Menschen gegenüber GFN die Bewertung der systemischen Toxizität im menschlichen Körper für zukünftige Studien unverzichtbar.

Fünftens ist ein weiteres wichtiges Thema, das Aufmerksamkeit erfordert, das langfristige Schicksal von GFNs, nachdem sie in den Körper gelangt oder von Zellen aufgenommen wurden. Die jüngsten Studien bestanden aus Bewertungen der Kurzzeittoxizität [89, 232], und toxische Langzeitschäden haben seit der weit verbreiteten Anwendung von GFNs im Jahr 2008 nicht viel Beachtung gefunden. Darüber hinaus kann eine funktionalisierte Graphenoberfläche ihre Biokompatibilität verbessern, aber die

Sechstens müssen spezifischere Signalwege im Mechanismus der GFN-Toxizität entdeckt und aufgeklärt werden. Derzeit wurden mehrere typische Toxizitätsmechanismen von GFNs veranschaulicht und allgemein akzeptiert, wie z. B. oxidativer Stress, Apoptose und Autophagie. Diese Mechanismen wurden jedoch nur allgemein beschrieben und die spezifischen Signalwege innerhalb dieser Mechanismen müssen im Detail untersucht werden. Auch die Signalwege, die an der Toxizität anderer Nanomaterialien beteiligt sind, können für die Untersuchung von GFNs von Bedeutung sein. Daher sollten in der zukünftigen Forschung weitere Signalwege entdeckt werden. So wurde beispielsweise die Nanoepigenetik in zahlreichen Studien zu Nanomaterialien berücksichtigt, was auch bei der Beurteilung der begrenzten Toxizität und Nebenwirkungen von GFNs hilfreich ist. Jüngste Studien haben gezeigt, dass GFNs epigenetische und genomische Veränderungen verursachen können, die physikalische Toxizität und Karzinogenität stimulieren können [234]. GFNs haben große Oberflächen, glatte, kontinuierliche Oberflächen und Bio-Persistenz, ähnlich den Eigenschaften von tumorigenen Festkörperimplantaten. Es ist nicht bekannt, ob GFNs das Potenzial haben, Fremdkörpersarkome zu induzieren, und daher sollten so bald wie möglich definitive Studien zu Tumorpotenzialen oder Risiken von Graphen durchgeführt werden.

Schlussfolgerungen
In den letzten Jahren wurden GFNs in zahlreichen technologischen und biomedizinischen Bereichen eingesetzt. Derzeit haben sich die meisten Experimente auf die Toxizität von GFNs in Lunge und Leber konzentriert. Daher verdienen Studien zu Hirnverletzungen oder Neurotoxizität in Zukunft mehr Aufmerksamkeit. Viele Experimente haben gezeigt, dass GFNs bei vielen biologischen Anwendungen toxische Nebenwirkungen haben, aber die eingehende Untersuchung der Toxizitätsmechanismen ist dringend erforderlich. Darüber hinaus müssen gegensätzliche Ergebnisse zur Toxizität von GFNs durch wirksame experimentelle Methoden und systematische Studien angegangen werden. Dieser Review bietet einen Überblick über die Toxizität von GFNs, indem er die Toxikokinetik, Toxizitätsmechanismen und Einflussfaktoren zusammenfasst und Informationen liefern soll, um in Zukunft eine gründliche Erforschung der Hämo- und Biokompatibilität von GFNs in vitro und in vivo zu erleichtern. Diese Überprüfung wird dazu beitragen, Sicherheitsbedenken vor der klinischen und therapeutischen Anwendung von GFNs auszuräumen, was für die weitere Entwicklung von GFNs in biologischen Anwendungen wichtig sein wird.

Abkürzungen
AM:
Alveoläre Makrophagen

BBB:
Blut-Hirn-Schranke

BEB:
Blut-Nebenhoden-Schranken

BTB:
Blut-Hoden-Schranke

CR:
Komplementrezeptor

FcgR:
Fcg-Rezeptor

BLG:
Wenigschichtiges Graphen

GFNs:
Nanomaterialien der Graphen-Familie

GNS:
Graphen-Nanoblätter

GEHEN:
Graphenoxid

GO-COOH:
Carboxyliertes Graphenoxid

GO-DEX:
GO-Dextran

GO-MB:
GO-molekulares Leuchtfeuer

GO-NH2:
Aminiertes GO

GO-PAA:
Poly(acrylsäure)-funktionalisiertes GO

GO-PAM:
Poly(acrylamid)-funktionalisiertes GO

GO-PEG:
PEGylierte GO-Derivate

GO-PEI:
GO-Polyethylenimin

GQDs:
Graphen-Quantenpunkte

GSH-PX:
Glutathionperoxidase

GXVG:
Carboxylgraphen

LDH:
Laktat und Dehydrogenase

MALDI:
Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation

MAPKs:
Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MDA:
Malondialdehyd

MØ:
Makrophage

HERR:
Mannose-Rezeptor

MSI:
Massenspektrometrie-Bildgebung

PC12-Zellen:
Phäochromozytomzellen der Ratte

PCGO:
Proteinbeschichtete Graphenoxid-Nanopartikel

PrGO:
PEGyliertes reduziertes Graphenoxid

RES:
Retikuloendotheliales System

rGO:
Reduziertes Graphenoxid

ROS:
Reaktive Sauerstoffspezies

SOD:
Hyperventilieren

TLRs:
Toll-like-Rezeptor

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BEB:

Blood-epididymis barriers

BTB:

Blood-testis barrier

CR:

Complement receptor

FcgR:

Fcg receptor

FLG:

Few-layer graphene

GFNs:

Graphene family nanomaterials

GNS:

Graphene nanosheets

GO:

Graphene oxide

GO-COOH:

Carboxylated graphene oxide

GO-DEX:

GO-dextran

GO-MB:

GO-molecular beacon

GO-NH2:

Aminated GO

GO-PAA:

Poly(acrylic acid)-functionalized GO

GO-PAM:

Poly(acrylamide)-functionalized GO

GO-PEG:

PEGylated GO derivatives

GO-PEI:

GO-polyethylenimine

GQDs:

Graphene quantum dots

GSH-PX:

Glutathione peroxidase

GXVG:

Carboxyl graphene

LDH:

Lactate and dehydrogenase

MALDI:

Matrix-assisted laser desorption/ionization

MAPKs:

Mitogen-activated protein kinase

MDA:

Malondialdehyde

MØ:

Macrophage

MR:

Mannose receptor

MSI:

Mass spectrometry imaging

PC12 cells:

Rat pheochromocytoma cells

PCGO:

Protein-coated graphene oxide nanoparticles

PrGO:

PEGylated reduced graphene oxide

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Reticuloendothelial system

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Reduced graphene oxide

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Reactive oxygen species

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Superoxide dismutase

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